Museum Fatahillah menyimpan koleksi yang menggambarkan perjalanan sejarah Jakarta, termasuk replika peninggalan dari masa Kerajaan Tarumanegara dan Kerajaan Pajajaran. Di museum ini, terdapat pula hasil penggalian arkeologis di Jakarta dan perabotan antik era kolonial Belanda dari abad ke-17 hingga abad ke-19.
Pengunjung dapat menemukan berbagai benda bersejarah seperti mebel, lukisan, keramik, hingga batu-batu kuno yang berkaitan erat dengan sejarah Jakarta. Selain itu, museum ini juga memamerkan berbagai jenis senjata dari masa kolonial Belanda, termasuk pedang. Salah satu daya tarik utama museum ini adalah penjara bawah tanahnya, yang dulunya berfungsi sebagai tempat penahanan bagi para tahanan, termasuk tokoh-tokoh masyarakat yang menentang penjajahan Belanda.
Penjara bawah tanah di Museum Fatahillah memiliki ukuran kecil, gelap, dan atap yang rendah sehingga tahanan tidak dapat berdiri dengan leluasa. Menurut keterangan seorang pemandu museum, penjara ini pernah digunakan untuk menahan tokoh-tokoh besar seperti Pangeran Diponegoro dan Cut Nyak Dien.
Untuk menarik minat pengunjung, museum ini menata koleksinya secara kronologis berdasarkan perjalanan sejarah Jakarta. Selain itu, koleksi-koleksi tersebut juga menggambarkan Jakarta sebagai pusat pertemuan budaya dari berbagai kelompok suku bangsa, baik masyarakat asli Indonesia maupun dari luar negeri.
Pameran koleksi di museum ini dilengkapi dengan presentasi grafis berupa foto, sketsa, gambar, peta, dan label deskripsi yang membantu pengunjung memahami setiap benda yang dipamerkan.
Selain artefak yang berkaitan langsung dengan sejarah Jakarta, museum ini juga menyimpan Patung Dewa Hermes, dewa dalam mitologi Yunani yang melambangkan keberuntungan dan pelindung bagi para pedagang. Patung ini terletak di kawasan perempatan Harmoni. Secara keseluruhan, terdapat sekitar 23.500 koleksi benda yang dipamerkan di museum ini, terdiri dari barang asli maupun replika.